Glicómica espacial: un protocolo de imagen MALDI multienzimático

Por qué el glicoma necesita su propio protocolo

Muchos metabolitos y lípidos se pueden visualizar directamente con MALDI. El glucógeno y los N-glicanos unidos a proteínas no: primero hay que cortarlos sobre el tejido con enzimas en fragmentos que el instrumento pueda detectar, y cada paso previo a la adquisición (la rapidez de congelación, el grosor del corte, la uniformidad de las enzimas y la matriz) se refleja en los datos.

Una digestión, las dos mitades del glicoma

El núcleo del método es una digestión multienzimática (con dos enzimas), que permite cubrir el glucógeno y los N-glicanos en un mismo corte: glicómica espacial y no una sola clase de glicanos. Dos enzimas se aplican juntas sobre el tejido, en una sola solución y una sola pulverización: la isoamilasa, que corta el glucógeno en sus cadenas de glucosa, y la PNGasa F, que libera los N-glicanos de sus proteínas. Tras una sola incubación, el mismo corte da ambas cosas.

Del lado del glucógeno: dónde está, cuánto hay (abundancia relativa), su distribución de longitud de cadena, leída a partir de cadenas que se diferencian en una unidad de glucosa (por ejemplo DP6, maltohexaosa), e información sobre cómo se ramifican esas cadenas. Del lado de los N-glicanos: especies individuales, cada una con su propio patrón, desde distribuciones en todos los hepatocitos hasta focos regionales y estructuras del tracto portal. El artículo lo describe como un flujo integrado para el análisis del glicoma.

El flujo de trabajo, paso a paso

En hígado de ratón fresco congelado: (1) recolección y congelación rápidas; (2) criosección con el grosor y la posición adecuados; (3) preparación del tejido y digestión con las dos enzimas; (4) matriz CHCA aplicada con un pulverizador HTX M5 y adquisición MALDI-MSI en modo positivo con pasos de 50 µm; y (5) procesamiento en flexImaging y SCiLS Lab para ubicar los mapas de glicanos en su contexto biológico.

Puntos de HRP (una glicoproteína) y de glucógeno de hígado de conejo sirven como estándares internos, así que cada corrida lleva su propia comprobación de que ambas enzimas funcionaron. El protocolo está pensado para adaptarse a otros tejidos, especies y plataformas MALDI.

Por qué importa

El método está pensado para definir la heterogeneidad glicómica espacial asociada a la función y disfunción hepática (el artículo lo demuestra en hígado de ratón de tipo silvestre), con un flujo diseñado para ser reproducible y sensible. Como JoVE publica el procedimiento en video, otro laboratorio puede ver cada paso en lugar de adivinarlo a partir de un párrafo de métodos.

Mi papel

Primer autor. La glicómica espacial (glucógeno y N-glicanos) era una de las tres familias de ensayos que realizaba de forma rutinaria en el CASBR, junto con la metabolómica y la lipidómica espacial, en proyectos de cáncer, neurodegeneración y enfermedades metabólicas raras.